家兔经皮给药安全性评价研究方法的探讨

透皮给药系统（TDDS）是一种通过皮肤吸收药物的方法，使药物进入人体血液循环并达到有效的血药浓度，从而预防或治疗疾病[1]。这种给药方式避免了肝脏的“首过效应”，保护了胃肠道免受药物损伤，还具有血药浓度持久恒定、患者依从性好、生物利用度和安全性高、价格低廉等诸多优点[2]。未来，TDDS可能成为继口服、注射给药之后新的研究热点，伴随的药物安全性评价研究也将大幅增加。

多年来，口服、注射剂型新药研究相对较多，优势和特点明显，其安全性评价方法较为成熟，相关文献报道也相对较多；而透皮给药的开发相对较少，且由于其安全性评价研究方法与传统口服制剂、注射剂有较大区别，目前文献中尚未见到关于透皮给药安全性评价研究方法的系统报道。 本文主要以国家食品药品监督管理局2014年5月13日颁布实施的《药物单次给药毒性研究技术指导原则》[3]、《药物重复给药毒性研究技术指导原则》[4]、《药物重复给药毒性研究技术指导原则》[5]（以下简称《指导原则》）以及人用药品技术要求国际协调会（ICH）指导原则[6]的相关要求为参考，结合作者多年的工作经验，以兔经皮给药为切入点，从动物选择、剂量设定、药物用量、皮肤脱毛及损伤模型制备、指标评价等多个方面对经皮给药进行了深入研究。 本文就该类受试药物毒理学试验研究所采用的方法进行探讨，旨在为该类受试药物的安全性评价研究提供方法学参考。

1 实验动物

目前，我国实验用兔主要有日本白兔、新西兰白兔、蓝兔、中国白兔四个品系，其中国际上通行的兔种以新西兰白兔和日本白兔最为常用[7]。从动物清洁度级别来看，兔可分为普通级、清洁级和SPF级，我国正在积极推荐和推广使用清洁级兔，国内大部分科研或验证、检验工作均采用清洁级兔，但作为国际标准的SPF兔由于饲养成本高、采购价格昂贵，在国内尚未得到广泛应用[8]。因此，在开展药物安全性评价研究过程中，生产厂家必须具有动物生产许可证和清洁级以上国际认可品种的动物质量合格证书，避免实验结果得不到业界认可。

关于所用动物的年龄，结合兔子的生物学特性，除一些特殊的研究用途或儿童、老人用药外，一般选择4～5月龄、性成熟的健康幼兔较为合适，在实验初期，值得一提的是，如果要在1个月内进行重复给药毒性试验，为保证评价结果的稳定性和可靠性，可以考虑将动物年龄再推迟1个月。另外，实践经验表明，兔子体重也是保证实验研究质量的重要因素，一般来说，同龄体重较重的兔子对环境和实验操作的适应能力相对较强，在实验研究过程中适应性更强，容易得到可靠的结果，因此体重在3.0公斤左右的4～5月龄兔子更适合用于实验研究。

2 种剂量设置

开展试验前，首先要深入了解试验药品的相关信息，一般包括委托方提供的资料[如试验药品的基本信息、配方成分、剂型、有效剂量或人体用量、给药次数，以及试验药品的初步探索内容（如有）等]，相关文献资料（如相关药理、毒理等研究报告）。在此基础上，设计、开展样品前处理试验（必要时）和安全性评价相关的预应用或斑贴试验，以初步了解试验药品的理化性质、毒性等信息，为相应的正式试验提供剂量设定依据。

在正式实验研究的剂量设定中，由于透皮给药不同于口服、注射等直接进入动物体内的给药方式，用单位体表面积的给药剂量来表达更为直观，也更方便确定各剂量组动物的给药剂量。必要时，可以采用体重剂量来计算实验结束时的给药剂量。另外，对于需要进行伴随试验研究的主体实验（如皮肤刺激性、伴随毒代动力学等），剂量设定时应综合考虑各因素。

3. 剂量换算

在透皮给药试验中，动物给药剂量由给药面积和单位体表面积剂量决定，且与受试药物的毒性有直接关系，但《指导原则》对这两项均未作出要求。因此，在具体研究中，当受试药物的毒性较大时，研究者可根据试验目的，综合平衡给药面积与单位体表面积剂量的关系。当药物几乎无毒时，可在动物最大给药面积和单位体表面积最大剂量下考察药物的安全性[9]。此种情况下的单位体表面积最大剂量可根据受试药物的相关数据确定，也可通过预应用试验确定。但《指导原则》对动物最大给药面积并未作出明确规定，通过查阅文献报道[10-12]，一般以动物体表面积的10%作为透皮给药的最大给药面积。 这主要是根据《化妆品安全技术规范》中规定“污染部位面积不得小于动物体表面积的10%”[13]，因此本文在兔子身上进行外用药物毒性研究时，也以10%的体表面积作为参考。

从以上结果可以看出，两种公式计算出的动物体表面积相差不大，但由于不同标准体重动物之间的等效剂量换算所用的换算系数（R）都是采用经验公式得出的，因此建议采用经验公式计算动物体表面积。一般通过公式计算得到的理论给药面积往往不是整数值，实践经验表明，5cm2的精度即可满足兔皮给药的要求。

4 关键技术操作方法

4.1 皮肤脱毛

一般动物皮肤上都有浓密的毛，为了避免动物毛发影响皮肤对受试药物的充分接触和吸收，在进行透皮给药研究时，应将动物的给药部位(通常是背部、臀部或腹部)。

兔子脱毛的主要方法有拔毛、剪毛、剃毛、硫化钠或脱毛膏等。其中拔毛主要用于兔子皮肤小面积的快速脱毛。剪毛法脱毛后皮肤表面往往会残留一层参差不齐的毛茬，一定程度上影响了受试药物与皮肤表面的有效接触和吸收。硫化钠加脱毛膏脱毛法脱动物毛比较干净彻底，但其所含的化学成分对动物皮肤有损害，是否有刺激性或是否对皮肤毛囊造成微观损伤，或是否因皮肤吸收而对机体产生影响家兔的饲养方法，事先很难评估对受试药物的效果是否有相加作用； 此外，在长期给药周期实验研究中，当脱毛区域再次长出新毛或调整给药区域时家兔经皮给药安全性评价研究方法的探讨，该方法的重复操作也会给实验带来不便。与以上几种脱毛方法相比，剃毛操作简单，脱毛效率高且干净彻底，脱毛过程中虽然对动物皮肤有一定的物理刺激，但能很快恢复，符合动物健康要求，对大数量、脱毛面积大、多次给药、给药周期长的家兔进行药物安全性评价实验的要求。

剃毛时[10-11]，动作尽量轻柔，避免损伤剃毛部位的皮肤。剃毛后，用湿毛巾或纱布轻轻擦拭剃毛部位，去除附着在皮肤上的任何毛发。实验过程中，如果需要多次脱毛，频率将取决于是否影响给药和局部皮肤观察，以及动物毛发的生长速度（通常每周 1 至 2 次）。需要注意的是，为避免脱毛对皮肤造成机械刺激，皮肤刺激性评估应在脱毛后至少 0.5 h 进行。

4.2 皮肤损伤模型的制备

在皮肤给药安全性评价研究中，当需要考察受试药物对破损皮肤的毒性时，首先应制备动物皮肤损伤模型。兔皮肤损伤模型的制备方法主要有锐器刮擦法，包括用针或刀片刮擦、用铁梳刮擦、砂纸打磨、激光照射等。其中，用针或刀片刮擦和用铁梳刮擦是用适当的力量在脱毛区皮肤上制造出破损伤口的方法。兔皮肤相对较薄，操作人员很难控制力度以满足《指南》中“限制对表皮的损伤”的要求和动物间伤口的均匀性，对于需要反复损伤的实验，更是难以保证质量。虽然激光照射具有对动物痛苦小、操作方便、皮肤损伤深度和面积可控等优点，但该方法仅在烧烫伤治疗中作为受试药物皮肤损伤治疗的首选方法。 砂纸抛光是制备兔等动物破损皮肤最常用的方法，具体是使用砂纸（1000目左右）以适当的力度、沿一定的方向反复摩擦兔皮，直至皮肤呈现微微发红的状态。可见，此方法操作简单，对破损强度的控制要求不高，得到的皮肤破损程度也相对可控，也适用于需要反复破损的安全性评价试验。

在制备破损皮肤模型的过程中，需要注意的是，兔子的机体抵抗力比较弱，消毒不当容易导致破损部位皮肤感染以及全身感染，影响试验结果的判断。因此，在皮肤破损前，应做好兔子饲养环境的维护。对破损的仪器设备进行消毒；如有破损，先用75%酒精对破损皮肤进行消毒，待酒精挥发后再继续破损[14]。另外，如果试验过程中需要多次破损皮肤，应等到破损皮肤基本恢复正常后，再重复破损。

4.3 涂层固定及药物去除方法

给药前，将药物以擦、喷或贴敷的方式涂抹于动物无毛皮肤相应部位，贴敷以外的试验药物贴敷于皮肤后，覆盖1层柔软覆盖物(破损皮肤上的覆盖物必须是无菌的)，如硫酸纸、空白膏药等，用无刺激性胶带固定，再用颈圈固定，防止动物咀嚼覆盖物及进一步舔舐，颈圈或固定物脱落应及时处理(可用任何能防止动物舔舐或蹭掉试验药物的方法)。应用期满后应及时取下颈圈及固定物，除去试验药物。一般极性较大、易溶于水的试验药物，可用柔软材料(如医用纱布、医用脱脂棉等)蘸温水洗净(注意除去辅料或赋形剂时，应将其与试验药物分开)； 对于细小、不溶于水的试验药物，可用柔软物体（如医用脱脂棉、软纸等）反复擦拭试验药物，直至完全擦掉。直接用清水擦洗可能对动物造成感染。应使用无菌或灭菌过的柔软物体擦拭试验药物，并注意从伤口部位擦掉试验药物。

4.4 动物血液采集

在实验研究过程中家兔的饲养方法，当需要检查兔子的血常规、血清生化、电解质、毒代动力学等相关指标时，首先需要采血。但兔子体型相对较小，其四肢的静脉细而曲折，充盈不足，与狗、猪、猴等体型较大的动物相比，采血相对困难。根据兔子的生理特点及实际工作经验，从兔耳中心动脉采血，既能满足多个时间点的血量要求，又能满足血质要求，符合动物福利。但即便如此，采血依然比较困难，因为兔血中纤维蛋白含量高，凝固速度快，而耳动脉血管又细，弹性较小，当血管充盈不足时，或启动采血管时，采血管内瞬间负压使针尖处血管收缩，从而使血流减慢，甚至造成停滞。 如果不及时采取措施，血液很快就会凝固，采血就会失败。因此，为了避免操作过程中出现上述情况，采血者要实时注意血流速度，当血流速度减慢时，要及时用手指轻弹兔耳根部，用针头刺入前动脉，等到血流速度恢复后，血流速度即可恢复。

另外需要注意的是，兔子的循环血总量比较少（一般为体重的4%~7%），当一天采血总量超过循环血总量的10%时，就会对兔子的正常生理功能产生一定的影响[16]。因此，根据动物福利的要求，在实验研究过程中应尽量避免过采或过度采血。

5 评估指标

兔透皮给药评价指标主要包括一般临床症状、体征、给药后局部皮肤刺激情况、进食量、体重、体温、心电图、血常规及凝血、血清生化及电解质、胸骨骨髓象等。生理检查指标如组织器官的体积、颜色、质地等外部观察和病理检查以及器官质量、系数和器官/脑比值指标，一般不进行粪便寄生虫检查和尿液检查。在指标方面，研究者应以试验目的为出发点，结合受试药物的特点，合理选择观察或检查指标，综合评价受试药物的安全性。

但由于体温、心电图Ⅱ、血常规及凝血、血清生化及电解质等生理指标受动物自身应激反应影响较大，且家兔对环境和操作较为敏感，为减少应激反应家兔经皮给药安全性评价研究方法的探讨，应考虑性别对上述指标检测结果的影响。检测前应让动物有充足的时间适应环境及进行针对性的操作训练，操作尽量轻柔。同时，检测指标时，应在检测前至少进行两次，并以下两次结果的平均值作为基准值更为可靠。另外，为保证凝血指标检测结果的准确性，采血时应注意观察采血管的刻度线，因为采血管中含有定量的抗凝剂，可能会超过或超过刻度线。在心电图Ⅱ检查中，以检查时限指标为主，幅度为辅。 QT间期校正公式[经验公式QTc=QT间期/SQRT（RR间期）]对于兔子来说有所不同，对于狗、猴子等大型动物，值得大家注意。最后，在进行药物安全性评价的单次/重复给药毒性研究时，可以将毒代动力学和刺激性研究整合为伴随研究，一并进行考察。

六，结论

非临床安全性评价研究是指在实验室条件下，利用实验系统进行的评价药物安全性的试验，目的是通过毒理学试验揭露受试药物的毒性，以表明其临床安全性，从而降低临床研究安全性风险[17]。自20世纪30年代出现“磺胺类药物”、“沙利度胺”和“沙利度胺”等一批严重的药物不良反应以来，人们逐渐认识到药物临床前安全性评价研究的重要性，经过几十年的发展，已形成了比较完善的方法评价体系。但本文所述的透皮给药不同于其他药物给药方式，各种给药方式的受试药物安全性评价研究策略在2011年《药品安全评价报告》中大体一致，但对实验动物种属或品系的选择没有明确规定，皮肤刺激试验除外。 在透皮给药毒理研究中，通常使用大鼠、兔和/或小型猪作为实验动物，这被大多数研究者普遍接受。

从三种可用于透皮给药的动物特点来看，大鼠具有体型小、来源丰富、价格低廉等优点，一般作为啮齿类动物是首选，但其皮肤组织结构与人有较大差异，实验需要动物数量较多，同时为了防止动物间舔舐，均采用单笼饲养，有悖于动物群居的习性。对于小型猪，虽然其皮肤的功能结构与人十分相似，但近年来兔子在透皮给药研究中的使用也逐年增多，但它们也存在成本高、供应有限、体型较大、驯化程度不够等缺点。其体型较瘦，易于药物吸收，对刺激较为敏感，还具有体型适中、性情温和、来源丰富、价格低廉、易于驯养捕捉等优点，非常适合进行透皮给药的毒理学研究。 相对来说应用最为广泛，这也是本文选用兔子作为实验动物的主要原因之一。但兔子比较脆弱，如果饲养不当很容易死亡，而且比较容易受到应激的影响，导致一些生理指标的检测结果波动较大，因此在选择兔子时要慎重。操作方法也与其他给药方式有很多不同。

综上所述，本文以兔透皮给药安全性评价研究方法为切入点，结合作者多年的实践经验，对实验研究过程中可能影响评价质量的关键点进行了总结和探讨，为从事透皮给药安全性评价的科研人员提供方法学参考。

利益冲突 所有作者声明他们没有利益冲突

参考文献（略）

来源：杨洪波, 张百娥, 杨雪松, 杨昆芬, 王景坤. 兔经皮给药安全性评价研究方法探讨[J]. 药物评价研究, 2023, 46(5): 962-966 .