家兔的饲养方法 热原测定仪-热原检查技术及注意事项

热原是微生物的代谢产物，即能引起温血动物和人体温异常升高的致热物质，包括细菌热原、内源性高分子热原、内源性低分子热原和化学热原等。这些物质进入血液后，被吞噬细胞吞噬，产生内源性热原（内源性热原），作用于下丘脑体温调节中枢，导致动物体温升高，引起发热等一系列不良反应，必须严格控制。

除另有规定外，中国药典第二部规定，所有静脉注射剂均须进行热原或细菌内毒素检查。细菌内毒素检查和热原检查是不同的检查方法，但目的相同。热原检查采用家兔法，细菌内毒素检查采用鲎试剂法。

1. 兔子热原测试

中国药典二部采用兔法检查热原。将一定剂量的供试品静脉注射到家兔体内，在规定时间内观察家兔体温的上升情况，以测定供试品所含的热原。一定量的热原注射到家兔体内后，体温一般在15～30分钟内开始上升家兔的饲养方法，在70～120分钟内达最高峰。试验结果的准确性和一致性取决于试验动物的状态、实验室条件和操作的标准化。

1.实验动物

热原试验的实验动物为家兔，应符合下列要求：①健康合格，体重在1.7kg以上，母兔不得怀孕，在预计体温前7天以同样的饲料喂养，在此期间体重不得降低，精神、食欲、排泄等均不得有异常。②对于未进行热原试验的家兔；或试验产品经判断符合要求但体温升高0.6℃的家兔；或3周内未使用过的家兔，应在试验前3～7天测量体温进行选择。选兔试验条件与供试品相同，但不注入药液，连续4小时每隔30分钟测温1次，共计8只家兔，4小时内体温在38.0～39.6℃之间，体温升高不超过0.4℃即可用于试验家兔的饲养方法，至少休息48小时后可再次使用。体温升高0.6℃的家兔应休息2周以上。 ④热原试验不合格，该组家兔全部不能使用。每只家兔用于一般药物试验的次数不得超过10次。

2. 检验前的准备

1、每批试验产品初试取3只兔，复试取5只兔。试验前1～2天，应将试验兔饲养在同一温度环境中，实验室与饲养室温度相差不大于3℃，实验室温度以0.4℃为宜，在17～25℃之间。整个试验过程中，应注意室温变化不大于3℃。应防止动物吵闹，避免噪音干扰。

2.实验前至少1小时停止兔子进食，并将其放置在宽松合适的装置中直至实验开始。

完成。应使用精度为±0.1°C的测温装置测量兔子的体温。

测试的深度和时间每只兔子应相同，深度一般为6cm左右，时间不应少于1分半钟，每30分钟测一次体温，一般测两次，两次体温相差不应超过0.2℃，所以取三次体温的平均值作为一只兔子的正常体温。同一天使用的家兔正常体温应在38.0～39.6℃之间，同组兔子之间的正常体温相差不应超过1℃。

3.试验注射器、针头及一切与试验样品接触的器具均应放入烘箱中，在250℃下加热2分钟，或在180℃下加热2小时。也可采用其他适当方法去除热原。

（三）检查方法

1.在测量家兔正常体温后15分钟内，从耳静脉缓慢注入规定剂量并加温至38℃左右的测试液，然后每隔30分钟测量体温1次，连续6次。

2、每只兔子注射供试液后所测的6个温度中的正常体温与最高体温之差即为该只兔子的体温上升值。

（四）结果判定

1、满足下列条件者，判定符合要求：首次试验中，3只兔子体温升高不超过0.6℃，且3只兔子体温升高总和不超过1.3℃；或复试中，5只兔子体温升高不超过1.3℃，试验过程中家兔的饲养方法 热原测定仪-热原检查技术及注意事项，不超过1只兔子体温升高0.6℃及以上，且初试和复试中8只兔子体温升高总和不超过3.5℃。

2、若出现下列情况之一，则需重测一次：三只兔子中有一只温升达到或超过0.6℃；三只兔子的温升均低于0.6℃，但三只兔子的总温升达到1.3℃或1.3℃及以上。

3. 下列任何一种情况都将被视为不符合要求：初次试验的三只兔子中，有一只以上的兔子体温升高0.6℃或以上；或复试的五只兔子中，有一只兔子体温升高0.6℃或以上；或初次试验和复试中8只兔子的总体温升高超过3.5℃。

4、对于负值的规定是：当兔子的温升为负值时，按0℃测量。

（五）注释

1、建议尽量使用热原温度计测量体温，因为整个测温过程温度探头都放在兔门内部，兔子比较安静，测得的体温比较准确，同时也避免了因为1小时、2小时、3小时测一次温的规定而造成的漏测现象。

2、热原质耐热性好，在60℃加热1小时不分解、不破坏，在100℃加热也不降解，但在180℃加热3-4小时、200℃加热60分钟、250℃加热30-45分钟，热原质就会完全破坏。因此，生产过程中使用的玻璃制品、金属制品、容器等用具、注射用的注射器等耐热物品，都可用此方法销毁。

3.热原实验室内外保持安静，避免强烈阳光直射或灯光等刺激。室温应为17-25℃，整个试验过程中室温变化不应超过3℃。

4.注射一些试验品如三磷酸腺苷二钠时，应注意缓慢注射，否则易造成兔子死亡。

5、试验过程中，必须及时填写兔卡及原始记录。

2. 用鲎试验进行细菌内毒素检测

细菌内毒素检查法又称鲎试剂法，是利用鲎试剂与细菌内毒素发生反应，检测或定量药品中革兰氏阴性菌产生的细菌内毒素含量是否符合规定的方法。该法以其快速、灵敏、经济、重现性好等特点，得到日益广泛的应用，并有取代传统热原检查法的趋势。

1956年，美国动物学家Bang首次发现，给美洲鲎注射革兰氏阴性细菌会导致全身性

血液凝固。1968年美国血液学家列文博士和巴格博士最初阐明血液凝固是由于革兰氏阴性细菌内毒素激活鲎血阿米巴细胞裂解物中的酶，使裂解物中的可溶性蛋白质转化为凝胶而引起的。这种凝固反应极其灵敏，当内毒素浓度达0.001ug/ml时即呈阳性结果。20世纪70年代，美国提取阿米巴细胞裂解物制成试剂家兔的饲养方法 热原测定仪-热原检查技术及注意事项，创立了检测微量内毒素的检测技术。

细菌内毒素检测方法有凝胶法和光度法两种，后者包括浊度法和比色法。检测样品时，可用上述任何一种方法进行检测。如有争议，除另有规定外，以凝胶法结果为准。细菌内毒素的量以内毒素单位（EU）表示。

1. 标准产品

细菌内毒素工作标准品以国家细菌内毒素标准品为基准进行标定，用于鲎试剂的灵敏度验证、干扰试验及实验中的各类阳性对照。

2. 检验前的准备

1.试验器材处理试验器材必须经过处理以除去可能存在的外源性内毒素，常用的方法是250℃烘干至少30分钟，也可采用其他适当方法，以保证不干扰细菌内毒素检测。

如果使用塑料仪器，例如微量移液器测试仪的微孔板和移液器吸头，则应标记为无内毒素且不会干扰测试。

2.试验溶液的制备有些试验样品需用水溶液重新溶解稀释或提取后配制成试验溶液，一般要求试验溶液的pH值在6.0～8.0之间。

3.内毒素限度的测定药品和生物制品的细菌内毒素限度（L），一般按公式L=K/M确定。

式中，l为供试品的细菌内毒素限度，以EU/ml、EU/mg或EUU（活度单位）表示；K为人用每公斤体重每小时最大可接受内毒素剂量，以EU/（gh）表示；M为人用每公斤体重每小时最大供试品剂量，以m（kgh）、m/（kgh）或U/（kgh）表示。平均体重为60公斤，若注射时间不足1小时，则按1小时计算。

4.确定最大有效稀释倍数（MVD） 最大有效稀释倍数（MVD）是指供试品溶液的稀释倍数。

允许的最大稀释倍数，在此倍数下可以检测内毒素限度。通常通过公式MVD = CL/λ确定。

式中，L为供试品的细菌内毒素限度；C为供试品溶液的浓度，当L以EU/ml表示时，C等于1.0ml/ml，当L以EU/mg或EU/U表示时，C的单位应为mg/ml或U/ml，即凝胶法中鲎试剂的标示灵敏度（EU/ml），或光度法所用标准曲线上的最低内毒素浓度。

（三）检验方法：凝胶法

凝胶法为极限方法，是经典的细菌内毒素检查方法。凝胶法是指利用鲨鱼试剂与内毒素发生凝集反应的原理来检测或半定量内毒素的方法。在一定条件下，引起截止试剂凝集的内毒素最低浓度即为该试剂的标定灵敏度，以Eml表示。

1.试剂灵敏度验证试验当所用试剂批号或试验条件发生变化，可能影响试验结果时，需进行试剂灵敏度验证试验，在细菌内毒素检查法规定的条件下，能使鲎试剂产生凝集反应的试剂标准内毒素的最低浓度称为灵敏度。单位为EU/ml。常用鲎试剂的灵敏度有：0.5EU/ml、0.25EU/ml、0.125EU/ml、0.06EU/ml、0.03EU/ml。

根据鲎试剂灵敏度的指示值（λ），将细菌内毒素国家标准品或细菌内毒素工作标准品溶解于细菌内毒素检查用水中，然后配制成2λ、λ、0.5λ、0.25λ4个浓度的内毒素溶液。中国药典二部要求将细菌内毒素国家标准品溶解于细菌内毒素检查用水中后，在旋涡混合器上混合15分钟，以后每个稀释步骤均应在旋涡混合器上混合30秒。

在16支试管中各加入0.1 ml不同浓度的内毒素标准溶液，即每个浓度平行做4支试管；在2支试管中加入0.1 ml细菌内毒素测试水作阴性对照，轻轻混匀试管内溶液。混匀后封管，垂直放置于37℃±1℃的适宜恒温箱中60分钟±2分钟。将试管轻轻从恒温箱中取出，缓慢倒置180°，若管内有凝胶形成且凝胶不变形、不从管壁滑落，则为阳性；若无凝胶形成或形成的凝胶不坚固、变形、不从管壁滑落，则为阴性。试管保温和搬运过程中应避免震动，以防出现假阳性和阴性结果。

若浓度最高的2管均为阳性，浓度最低的0.5管为阴性，阴性对照管为阴性，则检测有效。反应终点浓度的几何平均值按公式计算，即试剂灵敏度的测定值（λc）=lg-1（∑x/4）。

其中λc是终点浓度（lg）的对数。终点浓度是指一系列递减的内毒素浓度中的最后一个阳性浓度。

只有当λ在0.5λ~2λ（含）之间时，才可用于细菌内毒素检测，且标示的灵敏度应为该批次鲎试剂的灵敏度。

2.干扰试验内毒素检查是在无干扰条件下试剂与内毒素发生的凝集反应，对新药在进行内毒素检查前或对无细菌内毒素检查项目的品种建立内毒素检查方法前，需进行内毒素检查。进行干扰试验；当鲎试剂配方、检测样品、生产工艺改变或试验环境发生任何可能影响检测结果的变化时，需重新进行干扰试验。试验方法如下。

（1）按表1制备溶液A、B、C、D，所用试验溶液应为不含内毒素、且不超过最大有效稀释度（MVD）的溶液，方可进行操作。

（2）当溶液A与阴性对照溶液D的平行管全部为阴性，且串联溶液C的结果均在鲎试剂灵敏度验证范围内时，测定有效。

（3）根据公式Es=lg-1（xs/4）和Et=lg-1（xt/4）计算C和B，其中xs为串联溶液C反应终点浓度的对数值（lg），xt为串联溶液B反应终点浓度的对数值（lg）。

当E在0.5～2（含0.5A至20）之间，以及E在0.5E、-2E（含0.5E、2E）之间时，认为供试品在此浓度下无干扰。若在MVD的稀释倍数下试验有干扰，则应将供试品溶液进一步稀释至不超过MVD，重新进行干扰试验。

表 1

序号 内毒素浓度/配制内毒素的溶液 稀释液 稀释倍数 所含内毒素浓度 平行管数量 A 无/供试液 —————— 2 12λ4 21λ4 B2λ/供试液 供试液 40.5λ4 80.25λ4 12λ4 21λ4C2λ/检验水 检验水 40.5λ4 80.25λ4D 无/检验水——————2

注：A为供试品溶液；B为干扰试验系列；C为试剂标示灵敏度的对照系列；D为阴性对照。

可通过将供试品稀释至更大倍数或其他适当方法（如过滤、中和、透析或加热处理）来消除干扰，使毒素失去活性，再用预先加入标准内毒素处理的供试品溶液进行干扰试验。

3. 凝胶极限试验按表2制备溶液A、B、C、D。用稀释倍数为MVD并消除干扰的试验样品溶液制备溶液A和B。

表 2

序号 内毒素浓度/配制内毒素溶液平行管数 A 无/供试液 2 B 2λ/供试液 2 C 2λ/试验水 2 D 无/试验水 2

注：A供试品溶液；B供试品溶液阳性对照；C阳性对照；D阴性对照

（四）结果判定

保温60分钟±2分钟后观察结果。

1.若阴性对照液D平行管全部为阴性，供试品阳性对照液B平行管全部为阳性，阳性对照液C平行管全部为阳性，则试验有效。

2.若溶液A的两支平行管均为阴性，则判定该供试品符合要求。

3.若溶液A的两支平行管均为阳性，则判定该供试品不合格。

4、若溶液A的两个平行管中有一个为阳性，另一个为阴性，则需进行复测，复测时需将溶液A制成4个平行管，若所有平行管均为阴性，则判定该供试品的细菌内毒素符合要求，否则判定该供试品的细菌内毒素不符合要求。

（五）注释

1、试剂的生物活性在pH6.0-8.0范围内稳定，当pH≤3或≥10时，酶活性受到抑制，因此试验时应将试验液pH调节至6.0-8.0

2、试验操作时应防止微生物污染，水浴保温时应避免强烈震动，混匀时应使用涡旋混合器，试管必须垂直于插板，试管溶液最好不超过试管高度的1/3。

（六）热原检查法与细菌内毒素检查法适用范围比较

热原检查法（兔法）可检测内毒素热原和非内毒素热原所引起的热原反应；细菌内毒素检查法（鲎试剂法）只检测细菌内毒素的含量。

兔法检测内毒素的灵敏度为0.001μg/ml，试验结果接近人体内实际情况，但操作繁琐，耗时长，不能用于注射剂生产过程中的质量控制，也不适用于放射性药物、肿瘤抑制剂等细胞毒药物制剂。鲎试验对内毒素的灵敏度为0.0001μg/ml，比兔法灵敏度高10倍，操作简单，试验费用低，结果快速可靠，适用于热原控制及注射剂的国产化。兔法不能检测某些细胞毒药物制剂，但对革兰氏阴性菌以外的内毒素不敏感，目前不能完全取代兔法。